[硕士论文] RNA干扰Hsp72基因对小鼠早期胚胎发育影响的研究 [复制链接]

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硕士论文-RNA干扰Hsp72基因对小鼠早期胚胎发育影响的研究，共55页，30284字

摘 要

RNA干扰（RNAi）现象普遍存在于生物体细胞中，在理论上已清楚其分子机制，

为蛋白质功能研究提供了新的方法。本研究设计合成了针对小鼠胚胎诱导型热休克蛋白

70（Hsp72）基因的瞬时干扰siRNA，旨在通过RNAi技术干扰Hsp72 基因的表达，以研

究Hsp72 基因沉默对小鼠早期胚胎发育的影响。试验通过RT-PCR和Western blot检测

Hsp72 mRNA和Hsp72 蛋白表达量，成功筛选出了对小鼠Hsp72 基因具有显著抑制效果

的siRNA，并借助LipofectamineTM 2000 转染小鼠 4-细胞期胚胎，通过分析胚胎的囊胚发

育率和孵出率，研究Hsp72 在保护胚胎抗热应激方面的作用。

试验方法：

1. 选择GenBank报道的小鼠Hsp72 基因序列上的 4 个位点，体外化学合成 4 对

siRNA，借助LipofectamineTM 2000 转染小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。试验分为 37℃对

照组和热应激组，热应激组包括 4 个siRNA组，阳性对照组，阴性对照组及空白对照组。

MEF在 37℃、5% CO2、100% RH条件下预平衡的DMEM培养液中培养。热应激组MEF

转染 6 h后更换为正常DMEM培养液，36 h后在 41℃、6% CO2条件下应激 2 h，之后通

过RT-PCR和Western blot检测细胞中Hsp72 mRNA和Hsp72 蛋白表达量，筛选出对小鼠

Hsp72 基因表达抑制效果显著的siRNA。

2. 将最佳siRNA72 瞬时转染 4-细胞期小鼠胚胎。试验分为 37℃对照组和热应激组，

热应激组包括siRNA72 组、阳性对照组、阴性对照组和空白对照组。胚胎在 37℃、5%

CO2、100% RH条件下预平衡的葡萄糖-CZB培养液中培养。热应激组胚胎转染 6 h后更

换为正常葡萄糖-CZB培养液。胚胎发育到囊胚后，热应激组在 41℃、6% CO2条件下热

应激 2 h，之后通过RT-PCR和Western blot检测Hsp72 mRNA和Hsp72 蛋白表达量。同时，

siRNA转染 4-细胞期胚胎后 48 h，统计各组胚胎由 4-细胞发育到囊胚的数目，热应激 48

h后，统计各组胚胎的孵出囊胚数目（包括正在孵出和已经孵出的囊胚）。计算囊胚发育

率和孵出率。

目录

中文摘要 .......... 1

英文摘要 .......... 3

缩略符号 ........Ⅰ

文献综述 .......... 1

第一章 热休克蛋白 70 在附植前胚胎中的表达及作用 ............ 1

1 前言 . 1

2 热休克蛋白 70 概述 . 1

2.1 热休克蛋白 70 的分类及生物学功能.......... 1

2.2 热休克蛋白 70 表达的基因调控..... 2

3 热休克蛋白 70 与早期胚胎发育........ 3

3.1 体内发育胚胎中热休克蛋白 70 的表达...... 3

3.2 体外培养胚胎中热休克蛋白 70 的表达...... 3

4 热休克蛋白 70 对胚胎的保护作用.... 4

4.1 提高胚胎的热耐力 4

4.2 分子伴侣作用 ........ 4

4.3 抗细胞凋亡作用 .... 5

4.4 抗氧化作用 ............ 5

5 热休克蛋白 70 对胚胎的不利影响.... 6

第二章 RNAi 的方法及其应用 7

1 前言 . 7

2 RNAi 的分子机理 ...... 7

2.1 siRNA 的生成 ......... 7

2.2 RISC 的形成 ........... 8

2.3 RNAi 效应.. 8

3 细胞中产生 siRNA 的方法 ... 9

3.1 长的 dsRNA ........... 9

3.2 siRNA ......... 9

3.3 siRNA 库 .. 10

3.4 DNA 载体介导的 RNAi .... 10

3.5 病毒载体介导的 RNAi..... 10

4 dsRNA 的转染方法 . 11

4.1 直接注射法 .......... 11

4.2 脂质体介导的转染法 ....... 11

4.3 电穿孔法 . 12

5 siRNA 干扰细胞特异功能基因的检测方法.. 12

5.1 RT-PCR 检测被干扰目的 mRNA 的转录水平........ 12

5.2 Western blot 分析被干扰基因的蛋白质表达水平... 12

6 展望及存在的问题 . 12

研究内容

试验一 RNA 干扰小鼠胚胎 Hsp72 基因有效序列筛选 ........... 14

1 试验材料 .... 14

1.1 试验动物 . 14

1.2 试剂与仪器 .......... 14

2 试验方法 .... 15

2.1 小鼠胚胎成纤维细胞的制备和培养.......... 15

2.2 siRNA 的化学合成 ............ 15

2.3 试验分组 . 16

2.4 siRNA-LipofectamineTM 2000 混合物的制备及细胞转染 ... 16

2.5 RT-PCR 检测细胞转染后 Hsp72 mRNA 的表达 .... 16

2.6 Western blot 检测细胞转染后 Hsp72 蛋白表达水平 ........... 18

2.7 数据处理 . 20

3 结果 ............ 20

3.1 siRNA 对 Hsp72 mRNA 表达的影响 ......... 20

3.2 siRNA 对 Hsp72 蛋白表达的影响 . 21

4 讨论 ............ 22

试验二 RNA 干扰 Hsp72 基因表达对小鼠早期胚胎发育的影响 ....... 24

1 试验材料 .... 24

1.1 试验动物 . 24

1.2 试剂与仪器 .......... 24

2 试验方法 .... 24

2.1 胚胎体外培养 ...... 24

2.2 siRNA 的选择 ....... 25

2.3 胚胎分组 . 25

2.4 siRNA-LipofectamineTM 2000 混合物的制备及胚胎转染 ... 25

2.5 RT-PCR 检测胚胎转染后 Hsp72 mRNA 的表达水平 ......... 25

2.6 Western blot 检测胚胎转染后 Hsp72 蛋白表达水平 ........... 26

2.7 胚胎发育率检测 .. 26

2.8 数据处理 . 26

3 结果 ............ 26

3.1 siRNA 对 Hsp72 mRNA 表达的影响 ......... 26

3.2 siRNA 对 Hsp72 蛋白表达的影响 . 27

3.3 胚胎发育率 .......... 28

4 讨论 ............ 28

结论 ........ 30

参考文献 ........ 31

致谢 ... 37

附录 .......... 38

攻读硕士学位期间发表的学术论文 ... 41

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