[硕士论文] 猪圆环病毒Ⅱ型全基因组的克隆与序列分析及ORF1基因的原核表达 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-猪圆环病毒Ⅱ型全基因组的克隆与序列分析及ORF1基因的原核表达，共77页，33838字

摘 要

猪圆环病毒Ⅱ型（porcine circovirus 2,PCV2）是断乳仔猪多系统衰竭综合症

（post-weaning multi-systemic wasting syndrome,PMWS）的主要病原。它不但可以

引起断奶仔猪衰竭、死亡，还与仔猪 A2 型先天性震颤（congential tremor type A

摘要

II,CT）、怀孕母猪流产(reproductive

failure)

、成年猪皮炎肾炎综合征（porcine

dermatitis and nephropathy,PDNS）和呼吸道疾病综合征（porcine respiratory disease

syndrome,PRDS）有关。这些疾病的广泛流行严重影响了养猪业，给世界上养猪国

家和地区带来巨大损失，更为严重的是 PCV2 还可引起免疫抑制，导致其它病原

的混合感染，造成的间接损失难以估计。

本论文的试验由两部分组成，一是从疑似病料里一次性克隆得到 PCV2 的全基

因组序列，二是亚克隆 PCV2 的 ORF1 基因，并在 pET-28a(+)中进行了原核表达。

1.参照国外发表的猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）全基因组序列,设计一对特异性引

物，利用该室保存的疑似断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）病料为模板，从中

提取 PCV2 基因组 DNA，并以之为模板进行 PCR（polymerase chain reaction）扩增。

将扩增得到的全基因片断克隆到 pMD18-T 载体上，经蓝白斑筛选和重组质粒 PCR

鉴定出阳性克隆并进行序列测定与分析，阳性质粒命名为 PCV2 all。用 DNAstar

工具将其与 GenBank 上国内外毒株进行了序列比较。结果表明扩增出了 1767bp 的

片段，序列分析表明与国内外毒株核苷酸同源性为高达 99.6%。

2.PCV2 的 ORF1 基因是 PCV2 基因组中最大的一个阅读框，编码病毒复制相

关蛋白，也称为 Rep 基因。设计一对特异性引物，以克隆得到的 PCV2 all 为模板，

利用 PCR 技术，扩增出了 945bp 大小的 ORF1 基因片断，亚克隆到 pMD18-T 载体

上，分别对阳性质粒和表达载体进行 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切，将 ORF1 片断以正

确读码框插入 pET-28a(+)中，构建了重组质粒 pET-ORF1。经 IPTG 诱导，成功表

达了 ORF1 基因编码的蛋白。表达的蛋白为融合蛋白，分子量大约为 41KD。经

Western-blot 检测，重组蛋白可被阳性血清识别。

关键词：猪圆环病毒Ⅱ型；全基因组；序列分析；ORF1 基因；原核表达

目 录

摘 要................I

Abstract ............I

缩略词表....... IV

前 言............... 1

文献综述......... 2

1 病原学. 2

2 病毒的分子生物学研究进展. 4

3 圆环病毒致病机理............... 11

4 猪圆环病毒流行病学........... 12

5 圆环病毒病流行原因........... 14

6 圆环病毒诊断方法............... 15

7 防制... 17

8 研究目的及意义. 17

试验内容....... 19

试验一 猪圆环病毒Ⅱ型全基因组的克隆与序列分析..... 19

1 材料与方法......... 19

2 结果... 25

3 讨论... 29

试验二

猪圆环病毒Ⅱ型 ORF1 基因的克隆与原核表达 ................ 31

1 材料与方法......... 31

2 结果... 37

3 讨论... 42

全文总结....... 44

参考文献....... 45

附录........... 50

致谢........... 67

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