[硕士论文] 粉纹夜蛾细胞系QB-Tn9-4s的克隆以及克隆株生物学特性的研究 [复制链接]

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硕士论文-粉纹夜蛾细胞系QB-Tn9-4s的克隆以及克隆株生物学特性的研究，共47页，24266字

摘 要

QB-Tn9-4s 为本实验室建立的粉纹夜蛾悬浮性新细胞系，其苜蓿银纹夜蛾核型多角

体病毒（Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV）产量和重

组蛋白表达量与目前国际上应用最多的 BTI-Tn5B1-4 细胞相当。该细胞系在有血清培养

条件下达到最高密度时不结块，是一株有潜力的进行大规模细胞培养的新细胞系。本试

验对该细胞系进行克隆，并对克隆株的生物学特性进行研究，主要结果如下：

1. 利用 24 孔细胞克隆板对低传代悬浮细胞系 QB-Tn9-4s 进行克隆，获得 8 个克隆

株，分别命名为克隆株 QB-Tn-A、QB-Tn-B、QB-Tn-C、QB-Tn-D、QB-Tn-E、QB-Tn-F、

QB-Tn-G 和 QB-Tn-H。

2. 对各克隆株基因组 DNA 进行 RAPD-PCR 鉴定，结果表明各细胞克隆株与原始

细胞系 QB-Tn9-4s 具有相同的 DNA 扩增谱带。

3. 各克隆株的形态具有一定差异：克隆株 QB-Tn-B 为贴壁性细胞，其余 7 个均为

悬浮性克隆株；克隆株 QB-Tn-A、B、C、D 和 E 以梭形细胞为主，大约占细胞总数的

60% ~ 80%；QB-Tn-F、G 和 H 以棒状细胞为主，比例分别为 44.5%、49.5%和 80.0%。

4. 测定了 6 个克隆株的生长曲线和群体倍增时间，其中克隆株 QB-Tn-A 的群体倍

增时间最短为 21.37h，且与 BTI-Tn5B1-4 细胞相当；克隆株 QB-Tn-E 的群体倍增时间

次之（22.04h），倍增速度快于原始细胞系 QB-Tn9-4s（23.60h）；其余克隆株的群体倍

增速度均慢于原始细胞系。

5. 病毒侵染试验表明，各细胞克隆株对 AcMNPV 均较敏感，感染率在 92%以上，

平均每个细胞病毒多角体（OBs）产量在 85~110 个之间，其中克隆株 QB-Tn-A 多角体

产量略高于 BTI-Tn5B1-4 和 QB-Tn9-4s。克隆株 QB-Tn-A 和 QB-Tn-E 的出芽性病毒（BV）

产量与原始细胞系（3.37×107 TCID50/mL）接近，而其余 4 株均低于原始细胞系。

6. 重组蛋白表达水平测定表明，克隆株 QB-Tn-A 的 β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）

表达量最高为 1.91×104 IU/mL，是原始细胞 QB-Tn9-4s 蛋白表达量（1.38×104 IU/mL）

的 1.39 倍，具有差异显著性；克隆株 QB-Tn-B 第 7d 的分泌型碱性磷酸酶（secreted alkaline

phosphatase，SEAP）表达量最高为 2.69 IU/mL，是原始细胞 QB-Tn9-4s 蛋白表达量（0.76

IU/mL）的 3.51 倍，与 BTI-Tn5B1-4 的蛋白表达量没有差异显著性。

关键词：粉纹夜蛾；QB-Tn9-4s；悬浮细胞；细胞克隆；病毒产量；重组蛋白

目 录

中文摘要....Ⅰ

英文摘要....Ⅱ

前言......1

1.昆虫细胞培养 ...1

2.昆虫细胞系的应用 ........6

3.研究目的及意义 ............9

材料与方法10

1.试验材料 .........10

2.试验方法 .........11

2.1TNM-FH培养基的配制..........11

2.2 细胞培养方法11

2.3细胞克隆........11

2.4 基因组DNA的RAPD-PCR分析 .........12

2.5 细胞冻存与复苏.........14

2.6细胞克隆株生物学特性测定..14

结果与分析18

1.细胞克隆及克隆株形态 ...........18

2.克隆株基因组 DNA 的 RAPD-PCR 分析 ........19

3.细胞冻存与复苏 ..........21

4.细胞生长曲线和群体倍增时间的测定 21

5.细胞对病毒敏感性及病毒多角体产量的测定 .22

6.出芽性病毒产量的测定 ...........24

7.重组蛋白 AcMNPV-β-gal 表达水平分析 .........25

8.重组蛋白 AcMNPV-SEAP 表达水平分析........26

讨论............28

结论............30

参考文献....31

附录............36

致谢............37

硕士期间发表的学术论文..38

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