[硕士论文] 玉米核糖体失活蛋白基因z108在大肠杆菌中的表达及其对病原菌的抗... [复制链接]

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硕士论文-玉米核糖体失活蛋白基因z108在大肠杆菌中的表达及其对病原菌的抗性鉴定，共72页，39285字

摘要

核糖体失活蛋白对于植物抗病基因工程的研究具有积极的意义。玉米核糖体失活蛋

白( Maize Ribosome-Inactivating Protein )是在玉米胚乳中特异表达的一种Ⅲ型核糖体失

活蛋白，其主要酶学性质是具有RNA N-糖苷酶活性，可特异地水解28S rRNA 3’端茎环

结构的一个腺嘌呤残基以导致核糖体失活,阻止多肽链的延伸，从而抑制靶细胞中蛋白质

的生物合成。

本研究将自主克隆的玉米核糖体失活蛋白基因z108以可溶形式在大肠杆菌菌株

BL21(DE3)中获得表达，z108重组蛋白的分子量大小为52.1kD。经MagneHisTM纯化和凝

血酶酶切验证，用以芽孢杆菌和几种主要病原真菌的抑菌试验。

试验结果表明：1）浓度为 0.2765μg/μl 的 z108 纯化蛋白对枯草芽孢杆菌 bs-1 菌株、

地衣芽孢杆菌 bl-1 菌株和蜡样芽孢杆菌 bc-1 菌株具有明显的抑制作用。其中，对 bc-1

菌株的抑制作用最强，其菌落生长被完全抑制；稀释后的 z108 纯化蛋白对 bs-1 菌株、

bl-1 菌株的抑制作用明显下降，但对 bc-1 菌株的抑制作用仍很明显。

2） 浓度为 0.02765μg/μl 的 z108 纯化蛋白可完全抑制黄曲霉分生孢子的萌发，但

对黄曲霉菌丝的生长没有明显的抑制作用。

3）浓度为 0.02765μg/μl 的 z108 纯化蛋白可完全抑制番茄灰霉病菌、番茄枯萎病菌

和烟草赤星病菌分生孢子的萌发，z108 纯化蛋白对番茄枯萎病菌和番茄灰霉病菌菌丝的

生长能够表现出明显的抑制作用，但对烟草赤星病菌菌丝生长的抑制作用较小。

4) 浓度为 0.0553μg/μl的 z108 纯化蛋白对苹果炭疽病菌和苹果轮纹病菌分生孢子的

萌发具有很强的抑制作用；同时，也抑制上述 2 种苹果致病菌的菌丝生长。

关键词：玉米核糖体失活蛋白，原核表达，纯化蛋白，抑菌作用

目录

中文摘要……..1

英文摘要………...…………..2

缩略符号………………….....3

前言……..4

一、 文献综述………...........5

1. 核糖体失活蛋白的类型和分布………………....5

2. 核糖体失活蛋白的结构与特性………………....6

3. 核糖体失活蛋白的作用机制…………………....8

3.1 核糖体失活蛋白的酶学机制...8

3.1.1 rRNA N-糖苷酶活性……..8

3.1.2 核糖核酸酶活性…………………….…………...8

3.1.3 其它酶学机制…………….……………………...8

3.2 核糖体失活蛋白的抗病毒机制……………………...9

4. 核糖体失活蛋白的应用……………………......10

4.1 核糖体失活蛋白在植物抗病基因工程的应用…………………....10

4.1.1 RIP在植物抗病毒方面的应用………………….10

4.1.2 RIP在植物抗真菌方面的应用……………...11

4.1.3 RIP在植物抗昆虫方面的应用………………….12

4.2 核糖体失活蛋白在医学方面的应用…….………....13

5. 玉米核糖体失活蛋白…………...13

5.1 玉米核糖体失活蛋白的结构与特性……....14

5.2 玉米核糖体失活蛋白基因z108的氨基酸序列…………………....15

5.3 玉米核糖体失活蛋白在植物抗病基因工程的应用…………….…………16

二、 材料与方法………………......18

1. 材料……...18

1.1 菌种与质粒……….…………18

1.2 药品与主要试剂….…………18

2. 试验方法…………….…………..18

2.1 z108 重组蛋白的诱导表达………………....18

2.2 表达产物的鉴定与分析…………………....18

2.2.1 表达产物的鉴定………..18

2.2.2 表达产物的分析……………….…….…………19

2.3 SDS-PAGE 电泳……………..19

2.4 表达产物的纯化…………………….….…………...20

2.5 纯化蛋白的酶切鉴定…………………….…………20

2.6 纯化蛋白的浓度测定和标定…………….…………20

2.7 枯草芽孢的抑菌实验……………………....21

2.8 病原真菌的抑菌实验……………………....22

2.8.1 分生孢子的萌发条件测试……………………..22

2.8.2 对分生孢子萌发的抑制实验…………………..22

2.8.3 对菌丝生长的抑制实验..23

三、 结果与分析………………......24

1. z108重组蛋白的纯化与鉴定……………….......24

1.1 z108重组蛋白的诱导………..24

1.2 z108重组蛋白的纯化………..24

1.3 z108纯化蛋白的酶切验证…..24

1.4 z108纯化蛋白的浓度测定…..24

2. z108 纯化蛋白对芽孢杆菌的抑制作用…………………25

3. 分生孢子的萌发条件…………...27

4. Elution buffer对病原真菌孢子萌发和菌丝生长的影响………........27

4.1 Elution buffer对病原真菌孢子萌发的影响……...27

4.2 Elution buffer对病原真菌菌丝生长的影响…….28

5. z108纯化蛋白对黄曲霉的抑制作用…………………....29

5.1 z108 纯化蛋白对分生孢子萌发的抑制作用…………………….....29

5.2 z108 纯化蛋白对菌丝生长的抑制作用….....30

6. z108纯化蛋白对茄科主要病害的抑制作用…...30

6.1 z108 纯化蛋白对番茄灰霉病菌的抑制作用…………………….....30

6.2 z108 纯化蛋白对番茄枯萎病菌的抑制作用…………………….....32

6.3 z108 纯化蛋白对烟草赤星病菌的抑制作用…………………….....33

7. z108 纯化蛋白对苹果主要病害的抑制作用…............34

7.2 z108 纯化蛋白对苹果轮纹病菌的抑制作用…………………….....36

四、 讨论………………......38

1. z108纯化蛋白对芽孢杆菌的作用………….......38

2. z108纯化蛋白对黄曲霉的作用…………….......38

3. z108纯化蛋白对茄科主要病害的作用…….......39

4. z108纯化蛋白对苹果主要病害的作用………...39

第五章 结论……………….41

参考文献…………………...42

附图…………………...48

致谢

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