[硕士论文] 枯草芽孢杆菌XM16菌株抗菌蛋白的提取纯化及其作用机理的研究 [复制链接]

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硕士论文-枯草芽孢杆菌XM16菌株抗菌蛋白的提取纯化及其作用机理的研究，共76页，37674字

摘要

枯草芽孢杆菌 XM16 菌株是从苹果树上分离获得的一个对苹果霉心病病原菌具

有特效抑制作用的拮抗菌株，本文对该菌株产生的抗菌蛋白的发酵条件、提取纯化

进行了研究，明确了抗菌蛋白的存在及其抑菌范围，并对该抗菌蛋白的作用方式和

作用机理进行了研究。

发酵条件研究表明，XM16 菌株在以 BYP 为原料发酵培养时，30℃、200rpm

摇床振荡培养 48h，可获得最高活性发酵产物。发酵液经 8000rpm 离心 10min，获

得发酵上清液，向上清液中加入(NH4)2SO4 至 50%饱和度，4℃静止 5h 以上，4℃下

10 000rpm 离心 10min，收集沉淀，将沉淀溶于 pH 6.5 的磷酸缓冲液中，可获得最

大量的抗菌蛋白，上清液完全丧失抑菌活性。将制得的具有抑菌活性的粗蛋白进行

Sephacryl S-100 凝胶层析，通过核酸蛋白检测仪检测到了 2 个具有强抑菌活性的蛋

白吸收峰，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标明蛋白未纯化，应进一步分离才能得到单一

的蛋白组分。热稳定性测试表明，该抗菌蛋白耐高温，121℃高温、高压处理 25min

仍具有较强抑菌活性。

从拮抗菌株内提取的抗菌蛋白对病原菌的抑菌表现与活体菌株完全相同，而且

抑菌谱也十分相似，这说明 XM16 菌株在培养过程中能产生抗菌物质，从拮抗菌株

内提取的抗菌蛋白至少是该菌株所产生的抑菌物质的一种。抑菌谱试验表明，抗菌

蛋白对供试辣椒炭疽病菌、棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、苹果腐烂病菌、苹果炭

疽病菌等多种植物病原菌具有明显的抑制作用。

对抗菌蛋白的作用方式研究表明，抗菌蛋白对苹果炭疽病菌分生孢子形成没有影响，对西

瓜枯萎病菌分生孢子形成有一定影响；对两种供试病原菌的菌丝生长具有明显的抑制作用，并

能极大抑制该种病原菌分生孢子的萌发，即使分生孢子萌发，芽管也不同程度的畸形。通过显

微镜观察发现，抗菌蛋白处理后能使菌丝严重畸形，顶端及中部膨大，原生质泄漏，这为深入

研究其作用机理提供了重要依据。

以番茄叶霉病菌为靶标菌，进行了抗菌蛋白作用机理的研究。结果表明：①抗

菌蛋白的最小抑菌浓度为 1mg/mL，最小杀菌浓度为 2mg/mL。经抗菌蛋白处理的番

茄叶霉病菌菌丝顶端均产生了一个很大的球状泡，整条菌丝严重畸形，细胞内含物

发生外渗，在 260nm 处出现明显吸收峰，说明抗菌蛋白的作用位点在细胞膜上。②

抗菌蛋白对菌体可溶性蛋白的合成没有明显影响，也不具备分解细胞壁中几丁质的

能力。③抗菌蛋白接种番茄叶片，不但没有危害产生，而且还可促进番茄幼苗根的

生长、增加叶绿素含量、提高植物体内的 PAL、CAT 和 PPO 三种防御酶的活性。

关键词：枯草芽孢杆菌；XM16 菌株；抗菌蛋白；作用机理

目

录

中文摘要… i

ABSTRACTiii

第一章 综述1

1 农用抗生素的研究进展… 1

2 农用抗生素的主要结构和组分…………… 2

3 农用抗生素的作用机理… 6

4 农用抗生素的应用……… 11

5 本研究的目的、意义及内容……………… 13

第二章 抗菌蛋白的发酵、分离与提纯……15

1 材料与方法………………15

1.1 试验材料………………15

1.2 粗蛋白的提取及抗菌活性的检测………16

1.2.1 发酵培养基对产生抗菌蛋白的影响……16

1.2.2 发酵时间对 XM16 菌株产生抗菌蛋白的影响………………17

1.2.3 硫酸铵分级盐析的测定………………17

1.2.4 粗蛋白的提取………17

1.2.5 粗蛋白抑菌活性的检测………………17

1.3 粗蛋白的纯化…………17

1.3.1 Sephacryl S-100 凝胶层析………………17

1.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳……………18

2 结果与分析………………18

2.1 发酵培养基对 XM16 菌株产生抗菌蛋白活性的影响…………18

2.2 XM16 菌株适宜发酵时间的确定………18

2.3 硫酸铵最适饱和度的确定………………19

2.4 Sephacryl S-100 凝胶层析结果…………19

2.5 XM16 菌株蛋白粗提液稳定性测定………21

3 结论与讨论………………22

第三章 XM16 菌株及其抗菌物质对数种植物病原真菌的作用范围…………… 23

1 材料与方法……………… 23

1.1 材料…

23

1.2 XM16 菌株对病原菌的拮抗作用………… 23

1.3 XM16 菌株无菌滤液及其蛋白粗提液的制备……………… 24

1.4 XM16 菌株无菌滤液活性的检测………… 24

1.5 XM16 菌株蛋白粗提液对几种病原菌的拮抗作用………… 24

1.6 XM16 菌株灭活发酵液活性的检测及灭菌前后抗生物质活性的变化……… 24

2 结果与分析……………… 24

2.1 XM16 菌株对病原真菌的拮抗作用……… 24

2.2 XM16 菌株无菌滤液活性的检测………… 25

2.3 XM16 菌株蛋白粗提液对几种病原菌的拮抗作用………… 26

2.4 XM16 菌株灭活发酵液活性的检测及灭菌前后抗生物质活性的测定……… 26

3 结论与讨论……………… 27

第四章 抗菌蛋白对病原真菌作用方式的研究29

1 材料与方法……………… 29

1.1 供试材料……………… 29

1.2 抗菌蛋白对苹果炭疽病菌的影响………29

1.2.1 抗菌蛋白对菌丝生长及分生孢子萌发抑制作用的测定…29

1.2.2 抗菌蛋白对分生孢子形成及菌丝形态的影响……………30

1.3 抗菌蛋白对西瓜枯萎病菌的影响………30

1.3.1 抗菌蛋白对菌丝生长的抑制作用………30

1.3.2 抗菌蛋白对分生孢子形成和分生孢子萌发的影响………30

2 结果与分析………………31

2.1 抗菌蛋白对苹果炭疽病菌的影响………31

2.1.1 抗菌蛋白对菌丝生长的抑制测定………31

2.1.2 抗菌蛋白对分生孢子萌发的影响………32

2.1.3 抗菌蛋白对分生孢子形成和菌丝形态的影响……………33

2.2 抗菌蛋白对西瓜枯萎病菌影响的测定…34

2.2.1 抗菌蛋白对菌丝生长的抑制……………34

2.2.2 抗菌蛋白对分生孢子形成的影响………35

2.2.3 抗菌蛋白对分生孢子萌发的影响………35

3 结论与讨论………………36

第五章 抗菌蛋白对病原真菌作用机理的研究38

第一节 抗菌蛋白对番茄叶霉病菌细胞膜渗透性的影响………38

1 材料与方法………………38

1.1 试验材料………………38

1.2 试验方法………………39

1.2.1 抗菌蛋白对番茄叶霉病菌的抗生作用39

1.2.2 抗菌蛋白对番茄叶霉病菌菌丝形态的影响……………39

1.2.3 抗菌蛋白对番茄叶霉病菌细胞膜渗透性的影响………39

2 结 果与 分 析 …… ……… …… …… ………… ……… ………… …… …… 39

2 .1 抗菌蛋白对番茄叶霉病菌的抗生作用 测定结果…… 3 9

2.2 抗菌蛋白对番茄叶霉病菌菌丝形态的影响………………40

2.3 抗菌蛋白对番茄叶霉病菌细胞膜渗透性的影响…………40

3 结论与讨论………………41

第二节 抗菌蛋白对菌体内可溶性蛋白和细胞壁几丁质的影响………………43

1 材料与方法………………43

1.1 材料…43

1.2 方法…43

1.2.1 胶状几丁质的制备…43

1.2.2 XM16 菌株及抗菌蛋白对几丁质的影响44

1.2.3 菌株的培养…………44

1.2.4 菌丝制备……………44

1.2.5 菌丝体蛋白质的提取44

1.2.6 蛋白质含量的测定…44

2 结果与分析………………45

2.1 蛋白质溶液标准曲线的制作……………45

2.1.1 标准蛋白质溶液光密度值的测定……45

2.1.2 样品溶液蛋白质含量测定……………46

2.2 抗菌蛋白对几丁质的降解………………47

3 结论与讨论………………47

第三节 抗菌蛋白对番茄植株生长和某些防御酶系的影响…49

1 材料与方法………………49

1.1 材料…49

1.2 试验方法………………49

1.2.1 抗菌蛋白对番茄幼苗生长的影响和叶绿素含量的测定49

1.2.2 抗菌蛋白对番茄植株体内三种防御酶系的影响………49

2 结果与分析……………5 1

2.1 抗菌蛋白对番茄植株生长的影响……5 1

2.2 抗菌蛋白对番茄植株体内三种防御酶系的影响………5 1

3 结论与讨论……………5 3

致谢………54

参考文献…55

附录………60

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