[硕士论文] 鹅A－FABP基因克隆与多态性分析 [复制链接]

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硕士论文-鹅A－FABP基因克隆与多态性分析，共70页，34448字

摘要

脂肪型脂肪酸结合蛋白（Adipocyte Fatty Acid-Binding Proteins，A-FABP）是脂肪酸结合

蛋白中的重要因子，在哺乳动物中只在脂肪组织中表达。哺乳动物的 A-FABP 是甘油三酯的

贮存库，在甘油三酯的形成以及脂溶解的过程中 A-FABP 储存或释放出大量的脂肪酸，还具

有调节作用：影响细胞内信号转导和基因转录；改变细胞内氧化还原电位；改变细胞内与代

谢相关的酶的活性；增加脂肪酸在膜间的扩散，从而参与调控脂生成及溶解的生化循环。

本试验以五龙鹅和朗德鹅为研究对象，克隆了 A-FABP 基因内含子 2 和 3 的完整序列，

并用 3 种不同的酶酶切 PCR 产物，与鹅的肥肝性能进行统计分析，对其内含子 3 的序列进行

同源性分析和酶切分析，并利用 Real-time PCR 技术检测了 A-FABP 基因在脂肪、肝、腿肌等

10 种组织中的表达情况。结果如下：

1 根据鸡（AF432506）、鸭（DQ358123）、人（NM001442）、猪（SSY16039）等的 A-FABP

基因保守序列设计引物，运用 PCR 法从五龙鹅和朗德鹅血液中克隆了 A-FABP 基因内含子 2

序列，长 461bp（GenBank 登录号为 DQ647701）。并用 RFLP 的方法对其进行遗传多态性研

究，该扩增产物经 AspⅠ、HinfⅠ和 HaeⅢ酶切后，发现有 HaeⅢ-RFLP，并出现 AA、AB 和

BB 3 种基因型，其五龙鹅和朗德鹅的基因型频率分别为 0.7、0.2、0.1 与 0.372、0.465、0.163。

经 χ2 检验，五龙鹅和朗德鹅在 A-FABP 位点上处于 Hardy-Weinberg 平衡状态（P>0.05）。分

析基因型与鹅体重和肥肝性状时发现：基因型对五龙鹅体重无显著影响（P>0.05），而对填饲

的朗德鹅体重和肥肝性状有显著影响（P<0.05）。填饲的朗德鹅在体重和肥肝性状上基因型

AA 与 AB 和 BB 之间存在显著差异（P<0.05），而五龙鹅在体重性状上 3 种基因型差异不显

著（P>0.05）。在研究指标中两种鹅的 AA 基因型效应均大于 AB 和 BB 基因型。表明，这些

差异的不同可能反映了品种之间不同的遗传特性。A-FABP 可能是影响鹅肥肝性状的主效基

因或与主效基因相连锁，可用于更多鹅肥肝性状的标记辅助选择。

2 根据鸡的（AF432506）、鸭（DQ358123）等发表的编码区序列设计兼并引物，从五

龙鹅和朗德鹅基因组的 DNA 中克隆了包括内含子 3 的序列，长 1361bp（序列已提交

GenBank），其中完整的内含子 3 长 1278bp。鹅 A-FABP 基因内含子 3 与鸡的同源性达到了

75.0%。获得的序列与鸡相比发生了 60 个碱基缺失和 274 个碱基替换，鸡相对鹅发生了 51

个碱基缺失和 283 个碱基替换。通过对鹅 A-FABP 基因内含子 3 的基因组序列进行酶切分析

发现有 10 种常见的限制性内切酶的酶切位点 20 处，并且用分析软件表明该片断适合进行酶

3 根据已测得的不同动物 A-FABP 基因的保守区设计引物，提取朗德鹅脂肪、肝、心、

脾、肺、肾、胸肌、腿肌、睾丸、脑 10 种组织的 RNA，利用 Real-time PCR 技术检测了 A-FABP

基因在 10 种组织中的表达情况。最佳反应条件为：SYBR GreenⅠ终浓度为 1×，退火温度为

60℃时，此时，熔解曲线显示单峰且峰值单一。朗德鹅 A-FABP 基因在各组织中的表达量的

关系为：肝>脂肪>腿肌>脾>肺>心>胸肌>肾>睾丸>脑。表明肝脏和脂肪的表达量处在最高的

等级，腿肌、脾、肺、心处在第二等级，表达量次之，胸肌、肾、睾丸、脑处在第三等级，

有微量的表达。

关键词：鹅；A-FABP；肥肝重；体重；多态性；相关性

目 录

中文摘要……………… 1

英文摘要…… 3

缩略符号…………… 5

第一章 文献综述……… 6

1.1 综述前言………… 6

1 . 2 FA B P s 基 因 的 研 究 进 展 … … … … … … … … … … … … … … 6

1.3 A-FABP 基因的研究进展………8

1.4 A-FABP 基因变异与畜禽肉品质性状相关的研究……………10

1.5RFLP 作为畜禽肉质性状的分子标记的研究进展…… 12

第二章鹅 A-FABP 内含子 2 的多态性与体重及肥肝性状关系的研究…15

2.1 试验材料和方法15

2.1.1 试验材料……15

2.1.2质粒和菌株15

2.1.3 主要工具酶及试剂……………15

2.1.4 试验仪器16

2.1.5 所用溶液及其配制………17

2.1.6 试验方法18

2.2 结果与分析……………… 2 2

2.2.1 鹅血液 DNA 的提取………23

2.2.2 鹅 A-FABP 基因内含子 2 基因的扩增……………23

2.2.3 目的片段的转化及质粒 DNA 的 PCR 扩增检测…23

2.2.4 PCR 扩增结果与酶切分析……24

2.2.5 重组质粒的序列测定…………24

2.2.6 A-FABP 基因和基因型频率……25

2.2.7群体遗传平衡………………25

2.2.8 测序结果…25

2.2.9 A-FABP 基因型与肥肝性状的关系……………26

2.3 讨论…… 2 6

第三章

五龙鹅和朗德鹅 A-FABP 基因内含子 3 的克隆及序列分析……29

3.1 试验材料和方法………………29

3.1.1 试验材料……………… 2 9

3.1.2 试验方法……………… 2 9

试验结果分析………………30

3.2.1 五龙鹅和朗德鹅 A-FABP 基因内含子 3 的 PCR 扩增与鉴定…30

3.2.2 重组质粒的鉴定……………31

3.2.3 鹅 A-FABP 基因内含子 3 的基因测序结果及序列分析……………31

3.3 讨论………34

第四章

利用荧光实时定量 PCR 对鹅 A-FABP 基因的检测…………37

4.1 试验材料和方法………………37

4.1.1 试验材料…37

4.1.2 主要试剂………37

主要仪器……38

试验方法…39

4.1.5 鹅组织中总 RNA 抽提取………39

4.1.6 总 RNA 的逆转录反应…………40

重组质粒的构建………………40

标准曲线的制作………………41

Real-time PCR 检测 A-FABP 基因在组织中的表达量……………41

结果与分析41

4.2.1 鹅组织中 RNA 提取结果………42

4.2.2 标准曲线的制备……… 4 2

A-FABP 基因在组织中的表达量检测…………43

4.3 讨论…… 4 5

全文结论…… 47

参考文献…… 48

附录…… 53

致谢…… 59

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