[硕士论文] CpG-DNA对鸡免疫增强作用的研究 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-CpG-DNA对鸡免疫增强作用的研究，共76页，30458字

摘要

细菌 DNA 具有广谱的免疫刺激作用。在体内可以直接激活 B 淋巴细胞、单核

细胞、巨噬细胞和树突状细胞，诱导 IL-1 和 TNF-α 等多种细胞因子的分泌，此外，

还能间接刺激 NK 细胞、T 淋巴细胞。本研究通过人工合成 16 种序列的 CpG-

DNA，分别与 ND 疫苗合用免疫鸡，通过检测各项免疫指标，筛选出 4 种具有较强

免疫效果的 CpG-DNA 序列，后经在 SPF 鸡上验证并确定免疫效果最强的 3 种序

列，并且对其中 1 种进行体外克隆扩增，探讨采用质粒重组来扩增 CpG-DNA 代替

人工合成的技术路线。

1、人工合成 16 种含有 5’-PurPur-CG-PyrPyr-3’特征序列的 CpG-DNA。

2、将人工合成的 16 种不同 CpG-DNA 序列分别与 ND 疫苗合用，试验设 ND

疫苗组、生理盐水空白对照组，通过对体液免疫指标（ND HI 抗体效价）、细胞免

疫指标（MTT 法测淋巴细胞增殖能力、血细胞计数、酯酶染色法确定 T 淋巴细胞百

分率）以及免疫器官组织学观察的研究，综合评价不同序列 CpG-DNA 的免疫增强

效果，初步筛选出 4 种对鸡免疫增强效果较佳的 CpG-DNA 序列： AACGTT

AACGTT、AACGTC AACGTC、AGCGTC AGCGTC、AGCGCT

AGCGCT。

3、在初步筛选的基础上，利用 SPF 鸡进行免疫学对比试验，将初选的 4 种对

鸡 免 疫 增 强 效 果 较 佳 的 CpG-DNA 序 列 ： AACGTT

AACGTT 、 AACGTC

AACGTC、AGCGTC

AGCGTC、AGCGCT

AGCGCT 分别与 ND 疫苗合用免疫

SPF 鸡，通过检测体液免疫指标（ND HI 抗体效价）、细胞免疫指标（MTT 法测淋

巴细胞增殖能力、酯酶染色法确定 T 淋巴细胞百分率）免疫器官组织学等有关免疫

学指标，进一步验证了所选序列的免疫增强作用，并确定 AACGTT

AACGTT、

AACGTC AACGTC、AGCGTC AGCGTC 3 种序列在所选序列中免疫增强效果最

强，其中 AGCGTC AGCGTC 序列对提高体液免疫和细胞免疫效果更佳。

4、人工合成 AGCGTC

AGCGTC 序列及其互补链，并在其两端引入接头，

通过加热退火的方法使两条链配对成 CpG-DNA 单体，与 pMD 18-T 载体连接并转

化大肠杆菌通过蓝白斑筛选阳性质粒，EcoRI、SalI 酶切鉴定重组质粒，并测序。结

果表明 CpG-DNA 成功插入 pMD 18-T 载体。

5、对体外克隆得到的 pMD 18-T-CG 重组子大量培养通过碱裂解法大量提取质

粒，证明采用质粒重组的方法来扩增 CpG 代替人工合成的技术路线是可行的。

关键词：CpG-DNA；免疫佐剂；鸡；增强作用；细胞免疫；体液免疫

目录

前言…………ⅰ

中文摘要………ⅱ

目录…………ⅵ

第一章 文献综述1

1．CpG-DNA 免疫活性的发现……………2

2．CpG-DNA 作用机理…2

3． CpG-DNA 的应用………3

CpG-DNA 作为免疫佐剂的应用…3

CpG-DNA 作为 DNA 疫苗的应用4

CpG-DNA 在哮喘病治疗中的应用4

CpG-DNA 在肿瘤治疗中的作用…4

CpG-DNA 在抗感染中的应用……5

第二章

CpG-DNA 免疫增强序列的初步筛选…6

1．主要试剂、材料和仪器6

1.1 人工合成 CpG-DNA 序列…………6

1.2 NDV 抗原…………6

1.3 试剂6

1.4 仪器6

1.5 试验用鸡和疫苗……6

2. 试验分组和免疫方法……7

3. 实验内容和方法…………7

3.1 测定鸡 ND HI 抗体效价………………7

3.2 鸡淋巴细胞增殖试验7

3.3 α-醋酸萘酯酶染色和血常规细胞计数7

3.4 免疫组织器官样品的制备与观察……7

4. 统计方法7

5．结果与分析8

5 .1 . Cp G -D NA 对 鸡 HI 抗体 效 价 影 响… …… …… …… …… …… 8

5.1.1 结果与分析……8

5.1.2 讨论………………9

5.2. CpG-DNA 对鸡淋巴细胞增殖的影响……………10

5.2.1 结果与分析…10

5.2.2 讨论…………11

5.3. CpG-DNA 对鸡 ANAE +淋巴细胞百分率的影响……12

5.3.1 结果与分析…12

5.3.2 讨论…………13

5.4. CpG-DNA 对鸡白细胞、淋巴细胞总数的影响…………14

5.4.1 结果与分析……14

5 .4 . 1.1 Cp G- D NA 分子免疫佐剂对鸡白细胞总数的影响……14

5.4.1.2 CpG-DNA 分子免疫佐剂对鸡淋巴细胞总数的影响……15

5.5 CpG-DNA 分子免疫佐剂对鸡 ANAE +、ANAE -淋巴细胞数的影响…17

5.5.1 结果与分析17

5.5.1.1 CpG-DNA 对鸡 ANAE +淋巴细胞数的影响……………17

5.5.1.2 CpG-DNA 对鸡 ANAE -淋巴细胞数的影响……………18

5.5.2 讨论………20

5.6 CpG-DNA 对鸡免疫器官组织学的影响……………20

5.6.1 结果……………20

5.6.2 讨论………23

小 结………25

第三章

免疫增强作用最强序列的确定……27

1．主要试剂、材料和仪器………………27

1.1 人工合成 CpG-DNA 序列……………27

1.2 NDV 抗原………27

1.3 试剂……………27

1.4 仪器27

1.5 试验用鸡……………27

2. 试验分组和免疫方法………………27

3. 实验内容和方法…………28

3.1 测定 SPF 鸡 ND HI 抗体效价………28

3.2 鸡淋巴细胞增殖试验28

3.3 α-醋酸萘酯酶染色和细胞计数………28

3.4 免疫组织器官样品的制备与观察……28

4. 统计方法28

5.结果与分析28

5 . 1 . Cp G - D N A 对 S P F 鸡 H I 抗体效价的影响…28

5.1.1 结果与分析……28

5.1.2 讨论…………29

5.2 CpG-DNA 对 SPF 鸡的淋巴细胞增殖的影响……………30

5.2.1 结果与分析…30

5.2.2 讨论…………30

5 . 3 Cp G - DN Ad 对 S P F 鸡 A N A E +淋巴细胞百分率的影响……… 3 1

5.3.1 结果与分析…31

5.3.2 讨论…………31

5.4 CpG-DNA 对 SPF 鸡免疫 器官组织 学的影响 3 3

5.4.1 结果与分析 …33

5.4.2 讨论…………34

小 结……………35

第四章

CpG-DNA 的体外克隆扩增制备………36

1.材料和方法………………36

1.1 主要试剂………………36

1.2 CpG 寡核苷酸（ CpG-ODN）的人工合成…………36

1.3 主要仪器………………37

1.4

试剂的配制……37

2. 试验步骤37

2.1 CpG-DNA 的体外克隆扩增……………37

2.1.1 双链 CpG 单体(CpG-DNA)的制备 ………………38

2.1.2 CpG-DNA5’端磷酸化…………38

2.1.3 载体去磷酸化38

2.1.4 外源片段与载体连接…………38

2.1.5 连接产物的转化及阳性克隆的初步筛选………39

2.1.6 质粒的小量提取………………39

2.1.7 重组质粒的酶切鉴定…………39

2.1.8 pMD 18-T-CG 重组载体的序列测定…………39

2.2

质粒的提取…………41

2.2.1 质粒的大量提取………………40

2 .2.2 质粒纯度的鉴定…………… 4 1

3．结果…………41

3.1 pMD 18-T-CG 重组载体的构建…41

3.2 pMD 18-T-CG 重组载体的酶切鉴定………………41

3.3 pMD 18-T-CG 重组载体的序列测定42

3 .4 质 粒 纯度 的鉴 定 …… …… …… 4 2

4．讨论…42

小

结…………43

结论……………44

致谢……………45

参考文献………46

附录……………52

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