[硕士论文] PVS-CP基因转化马铃薯的研究 [复制链接]

资料简介：

硕士论文-PVS-CP基因转化马铃薯的研究，共72页，37347字

摘 要

本研究以鲁引 1 号、夏波蒂、早大白、大西洋 4 个品种的微型薯为材料，建

立了离体再生体系和转基因技术体系，并用 PVS-CP 基因转化马铃薯 4 个品种，

获得了转基因植株。

用脱毒微型薯获得的试管苗在 2MS 液体培养基上经 20 天培养即可获得

健壮的植株。选取健壮的试管苗在 MS+8%蔗糖 与 MS 大量元素＋微量元素＋肌醇

＋3mg/L 6-BA 的 2 种培养基上，经暗培养可以结出试管薯，为通过试管薯途径

保存与交流转基因材料提供了方便。

实验表明，鲁引 1 号、夏波蒂叶盘外植体在 MS+0.5mg/L NAA + 4mg/L 6-BA

培养基上可诱导出鲜绿色颗粒状、结构紧密的愈伤，愈伤在 MS+5mg/L 6-BA +

1mg/L ZT 培养基上可分化出不定芽，分化率分别为 86.7%和 93.3%。个品种的微

型薯切块在 MS+2mg/L IAA+1mg/L 6-BA+4mg/L ZT+6mg/L KT 的培养基上都可直接

诱导出不定芽，鲁引 1 号的诱导率为 63.3%，其他 3 个品种的诱导率均在 90.0%

以上。在 MS 培养基上可顺利生根，形成完整的植株。

用 PVS-CP 基因的上、下游引物及质粒 pGEM-pvs 为模板进行 PCR 扩增，琼脂

糖凝胶电泳显示扩增产物为约 900bp 的特异条带。用 Ultrafree-DA 试剂盒一步

离心法回收特异扩增条带并与 pGEM-T Easy 载体连接，连接产物转化受体菌

DH5α获得氨苄青霉素抗性菌落，经 PCR 及单、双酶切鉴定，筛选出了阳性

克隆，其重组质粒命名为 pGEM-pvsk。

pGEM-pvsk 经 KpnⅠ与 BglⅡ双酶切后回收目的基因片段，植物表达载体

pCambia-2300-35S-OCS 经 KpnⅠ与 BamHⅠ双酶切后回收 9Kb 的片段。2 个回收后

的 DNA 片段连接后转化受体菌 DH5α，经卡那霉素抗性筛选、质粒电泳检测、PCR

扩增及 XbaⅠ的单酶切鉴定，筛选出了阳性克隆，其重组质粒命名为 pCambia

2300-pvsk。结果表明 PVS-CP 基因已定向插入到植物表达载体上，即获得了

预期的 PVS-CP 基因的植物表达载体。该表达载体中 PVS－CP 基因受 CaMV35S 启

动子的驱动，基因的 3，末端是 OCS 终止子，在该质粒的 T-DNA 区除了 PVS－CP

基因外，还有 NPTⅡ基因。

pCambia2300-pvsk 转化农杆菌 EHA105，经卡那霉素与利福平抗性筛选、PCR

扩增及 XbaⅠ单酶切鉴定，获得了预期的转化子 EHA105(pCambia2300-pvsk)。

用农杆菌 EHA105(pCambia2300-pvsk)侵染马铃薯的叶盘和薯块外植体，经

卡那霉素抗性筛选获得了抗性不定芽及植株。4 个品种的抗性植株经 PCR 检测都

扩增出了 900 bp 的目的基因片段，即获得了 4 个品种的转基因植株。

关键词：马铃薯

试管薯

PVS-CP 基因

农杆菌

转基因植株

目录

摘要………………………....Ⅰ

英文摘要………………..…..Ⅲ

前言……….…..….…..………1

1 植物基因工程研究概况……………………..………………………2

1.1 植物性状的基因工程改良……..………..2

1.2 植物生物反应器………………......………….2

1.3 标记基因与转基因植物的安全性…………………….….3

1.3.1 抗性标记基因的剔除…4

1.3.1.1 共转化和遗传分离…………………….....…….4

1.3.1.2 位点特异性重组系统……………………....….4

1.3.1.3 转座子系统………………………....………….5

1.3.2 发展安全标记基因用于植物的遗传转化……….5

1.3.2.1 化合物解毒酶基因…………………….…...…..5

1.3.2.2 糖类代谢酶基因…………………...……..…….5

1.3.3 建立安全有效的转化体系………….......……….……6

2 马铃薯病毒病及抗病毒基因工程….....…7

2.1 马铃薯病毒及病毒病………...7

2.2 马铃薯抗病毒基因工程研究进展……………………...8

2.2.1 马铃薯抗病毒基因工程的主要途径………...……….8

2.2.2 抗 PVX 基因工程....….….…9

2.2.3 抗 PVY 基因工程……....…10

2.2.4 抗 PLRV 基因工程……………….…….……………10

2.2.5 抗 PVS 基因工程.....………11

材料和方法…………..….….……….12

1 材料……………………....………...12

1.1 植物材料…………………....12

1.2 菌种、质粒及载体………………...12

1.3 酶与试剂盒….......……………….12

1.4 主要试剂……….......…………….12

1.5 引物设计与合成….......………….12

2 方法………………...………………13

2.1 马铃薯试管苗的快繁………………………...……………..13

2.2 试管薯的诱导……….......………..13

2.3 愈伤组织诱导及植株再生……………………...…………..13

2.4 不定芽的直接诱导……………………...…………………..14

2.4.1 以叶片、茎段为外植体……………………......…………14

2.4.2 以微型薯切块为外植体……………......…………………14

2.5 生根……………..………………...15

2.6 PVS-CP 基因植物表达载体的构建…………………….....………....15

2.6.1 PVS-CP 基因的 PCR 扩增及 T-A 克隆………………..…………16

2.6.2 PVS-CP 基因植物表达载体的构建…………………………….....17

2.7 农杆菌 EHA105 的转化及菌液的制备...…………………..19

2.7.1 农杆菌 EHA105 感受态细胞的制备……………….…………….……………19

2.7.2 EHA105 的转化…………..……………….…………19

2.7.3 EHA105(pCambia2300－pvsk)的活化………….....……..19

2.7.4 菌液的制备…………………......………………….……..19

2.8 农杆菌菌液侵染浓度及时间的确定..…………….………..20

2.8.1 浓度的确定………………………....…….………….……20

2.8.2 农杆菌侵染时间的确定………………………..……20

2.9 外植体的转化及转基因植株的鉴定……….....………..….20

2.9.1 外植体的转化......…..….………20

2.9.2 转基因植株鉴定….....………………..…21

结果与分析…………….....……...……..22

1 试管苗的快繁及试管薯的诱导……….........…...22

2 植株的离体再生…………………......…24

2.1 愈伤诱导及植株再生……......…..24

2.2 不定芽的直接诱导……....……..27

2.2.1 以叶片为外植体………..……….………………………27

2.2.2 以微型薯为外植体…………..…………..……………..28

3 PVS-CP 基因植物表达载体的构建及农杆菌的转化….……..31

4 外植体的转化及转基因植株的鉴定…………….......………………….………………….34

4.1 Km 抗性实验………………….......…………….……………...34

4.2 农杆菌菌液浓度和侵染时间的确定….......…….……………..35

4.3 抗 Km 不定芽及植株的筛选…………………....……………..36

4.4 PCR 检测……………………….……………...………….38

讨论……...…..39

结论………………………..……….......43

参考文献………………………..….…..44

附录：溶液的配置………………………51

缩略语表..……54

致谢………….55

导师组意见56

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