[硕士论文] 猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白抗原表位基因的表达和猪流感间接ELI... [复制链接]

资料简介：
硕士论文-猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白抗原表位基因的表达和猪流感间接ELISA诊断方法的研究，共96页，47506字

摘要

（一）猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）

引起的母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为特征的一种新的病毒性传染病。N 蛋白抗原表

位是 PRRSV 抗原分型的主要依据，也是血清型鉴别诊断的抗原基础。本研究在以下

两个试验分别表达了欧、美型特异的 N 蛋白抗原表位基因，旨在为欧美型血清学鉴

别诊断方法的建立奠定抗原基础。

（I）本研究根据 PRRSV VR-2332 株的基因序列，设计了能够扩增美洲型的 N

蛋白抗原表位基因的一对含有 BamH I 和 Sal I 双酶切位点的引物，经 RT-PCR 技术从

提取的 VR-2332 株病毒 RNA 中扩增出大小为 186bp 的基因片段，将此基因克隆到

pGEX-6P-1 表达载体中，构建了重组质粒 pGEX-6P-1-N。将该重组质粒转化入宿主菌

BL21（DE3），用 IPTG 诱导表达后 SDS-PAGE 分析表明在 32.1kDa 处出现了目的条

带。确立了最佳诱导表达条件（IPTG 0.8mM、作用时间 5h），薄层扫描显示目的蛋

白相对含量为 47.8％，目的蛋白用 Glutathione Sepharose 4B 层析柱纯化后纯度可达

90％以上。经 Western-Blot 免疫印迹分析，该表达产物与美洲型 PRRSV 血清发生反

应，说明美洲型抗原表位基因获得了高效表达。

（II）参照 GeneBank 公布的 PRRSV Lelystad Virus（LV）株的核苷酸序列，设

计并合成一段串联的 N 蛋白抗原表位基因，将该基因亚克隆到表达载体 PQE30 上，

成功构建了重组表达质粒 PQE30-N。将该重组质粒转化入宿主菌 M15 中，用 IPTG

诱导表达后，结果出现约 10.5kDa 的融合蛋白，与预期大小相符。薄层扫描显示目的

蛋白相对含量为 46.5％，并用 Ni-NTA 层析柱对目的蛋白进行纯化后纯度可达 95％以

上。经 Western-Blot 免疫印迹分析，His 单抗可与融合蛋白中的组氨酸标签发生反应，

说明欧洲型 N 蛋白抗原表位基因获得了高效表达。

（二）本研究表达、纯化了猪流感重组 NP 蛋白，并以此为抗原建立了检测猪流

感抗体的间接 ELISA 诊断方法，对 ELISA 各反应条件优化后，初步组装了试剂盒。

试验结果表明，BIOFIL 公司生产的酶标板的变异系数为 7.6％，达到 ELISA 的要求；

NP 抗原最适包被浓度为 4μg/mL；最适封闭液为 0.5％明胶，封闭条件为 37℃封闭 2h；

血清稀释度为 1∶50，HRP-兔抗猪 IgG 的工作浓度为 1∶5000，待检血清和酶标二抗

的反应时间均为 37℃感作 1h ；底物在室温显色时间为 10min。根据已经建立的 ELISA

方法及反应条件，确定阴阳性临界值（S/P）为 0.4。用本试剂盒与 HI 共同检测了 120

份血清，符合率达 92.5％，与猪瘟等 8 种猪病的阳性血清无交叉反应。-20℃保存的

试剂盒于 2 个月内具有良好的批内及批间重复性，并进行了现地血清的检测应用。

猪流感间接 ELISA 诊断方法的建立为我国猪流感抗体监测和流行病学调查提供

了一种快速简便的血清学方法。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；N 蛋白抗原表位；欧洲型；美洲型；原核表达；

猪流感；NP 蛋白；间接 ELISA

目录

前言1

中文摘要1

英文摘要1

缩略语及符号·········1

第一章

文献综述一

文 献 综 述

猪繁殖与呼吸综合征的研究进展

一、病原及其分子生物学进展··1

二、PRRS 欧、美毒株蛋白之间的差异·········3

三、PRRS 诊断及欧、美型毒株的鉴别诊断·······7

结语·12

文献综述二

猪流感的研究进展

一、病原及其流行情况····13

二、猪流感的诊断方法····14

三、公共卫生学意义·····17

结语18

第二章

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型（VR-2332）N 蛋白抗原表位基

因的扩增、克隆及高效表达

1.材料和方法········19

2.结 果·29

3.讨 论··35

4 小 结··········37

第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型（LV）N 蛋白抗原表位基因的

合成、克隆及高效表达

1.材料和方法········38

2.结 果46

3.讨 论·49

4.小 结50

第四章猪流感间接 ELISA 诊断方法的建立

1.材料52

2.方法55

3.结果59

4.讨论69

5.小结70

结论···71

参 考 文 献73

致谢·········83

资料文件预览：
共1文件夹，1个文件，文件总大小：2.01MB，压缩后大小：640.13KB

• 硕士论文-猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白抗原表位基因的表达和猪流感间接ELISA诊断方法的研究
• 硕士论文-猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白抗原表位基因的表达和猪流感间接ELISA诊断方法的研究.doc  [2.01MB]