[硕士论文] 苹果胚状体再生体系建立及Vf基因转化初探 [复制链接]

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硕士论文-苹果胚状体再生体系建立及Vf基因转化初探，共62页，35169字

摘要

苹果黑星病是世界上重要苹果产区的主要病害之一。近几年，该病在我国部

分地区有发病报道，威胁着我国苹果产业的发展。利用植物转基因技术，将对苹

果黑星病具有抗性的 Vf 基因导入优质苹果当中，可获得对黑星病具有高抗性的

优质苹果新品种，从而加快苹果抗黑星病育种的进程。

本研究以两个苹果品种‘鲁加六号’和‘富士’的组培苗为试材，建立了高频稳

定的胚状体再生体系，在此基础上初步建立了‘鲁加六号’的遗传转化体系，进行

PCR 初步检测获得了 Vf 基因转化植株。主要取得了以下研究结果：

1、确定了两个苹果品种的最佳增殖培养条件

研究表明，‘鲁加六号’和‘富士’都具有良好的增殖能力，其增殖培养的最佳

培养基为：MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+Suc3%+Agar0.7%，pH5.8 和 MS+BA1.0

mg/L+NAA0.1mg/L+Suc3%+Agar0.7%，pH5.8。平均增殖倍数分别达到 5.3 和 4.7。

2、获得了‘鲁加六号’和‘富士’苹果高频稳定的胚状体再生体系

确定了两苹果品种最佳胚性细胞诱导培养基为 MS+BA1.0+NAA5.0+TDZ

0.5mg/L。胚胎发育阶段，胚胎发育培养基为 MS+BA1.0+NAA0.1，最佳暗培养

时间为 10d，叶片的最佳放置方式为近轴面接触培养基。叶片再生率可分别达到

100%和 96.7%。通过胚状体不同时期形态学组织学观察，结果显示胚状体发育

时期经历原胚、球形胚、心形胚、子叶形胚、鱼雷形胚、成熟胚等不同形态阶段。

同时，研究发现以 1/2MS+IAA0.1mg/L+IBA0.1mg/L 为生根培养基，‘鲁加六号’

苹果平均单根长较长且生根率较高，达 86.7%。

3、初步建立了‘鲁加六号’苹果遗传转化体系，并得到了 2 个转化系。

结果表明，叶片切伤后黑暗预培养 3 d，农杆菌侵染后，共培养时间为 72 小

时，不添加乙酰丁香酮；延迟培养阶段头孢霉素浓度为 200mg/L，时间为 6 d；

选择培养阶段，芽分化过程卡那霉素浓度为 15mg/L，生根过程卡那霉素适宜浓

度为 10mg/L。

4、经 PCR 检测表明 Vf 基因已整合到‘鲁加六号’苹果基因组中

采用 CTAB 法提取转化植株的 DNA，利用人工合成引物进行 PCR 扩增。结

果表明，外源 Vf 基因已整合到‘鲁加六号’苹果基因组中。

关键词：苹果；Vf 基因；再生；遗传转化；胚状体

摘要 ...I

英文摘要 ......... II

缩略词（Abbreviation） ...............IV

引言 .. 1

第一章 文献综述 ............ 2

1 苹果黑星病研究进展...........2

1.1 苹果黑星病菌研究现状............. 2

1.2 Vf 基因研究进展 ........ 3

2 苹果转基因研究进展...........5

2.1 植物基因转化的受体系统......... 5

2.2 影响苹果叶片再生的因素......... 7

2.3 苹果遗传转化研究进展............. 9

3 转基因植物的检测与鉴定. 11

第二章 两苹果品种胚状体再生体系的建立............... 13

1 材料和方法.........13

1.1 材料........... 13

1.2 方法........... 13

2 结果与分析.........15

2.1 增殖培养基的筛选... 15

2.2 最佳胚状体再生培养基的确定............... 16

2.3 胚状体不同时期形态和组织学观察....... 21

3 讨论 ....22

3.1‘鲁加六号’与‘富士’生长特性的比较............ 22

3.2 体细胞胚发生的主要阶段....... 22

3.3 TDZ 对体细胞胚胎发生的作用 .............. 23

3.4 暗培养对胚状体再生的作用... 23

3.5 植株形成过程中胚状体的不同发育形态............... 24

第三章 Vf 基因转化‘鲁加六号’的研究 .. 29

１ 材料与方法.......29

1.1 材料........... 29

1.2 方法........... 30

2 结果与分析.........34

2.1 适宜卡纳霉素选择压的确定... 34

2.2 Kan 对生根的影响 ... 35

2.3 最佳抑菌抗生素浓度的确定... 35

2.4 最佳共培养时间的确定........... 36

2.5 最佳延迟培养天数的确定....... 37

2.6 乙酰丁香酮对基因转化的作用............... 38

2.7 转化植株的 PCR 检测 ............. 38

3 讨论 ....40

3.1 胚状体转化体系的特点........... 40

3.2 菌液浓度与侵染时间对侵染效果的影响............... 40

3.3 选择压的确定与抗性植株的选择........... 40

3.4 转基因植株的表达及检测....... 41

附图 42

结论 43

致谢.... . . .... ....... .. 45

参考文献 ........ 46

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