[硕士论文] 小鼠Hsp70基因序列分析及其在囊胚内表达的研究 [复制链接]

资料简介：
硕士论文-小鼠Hsp70基因序列分析及其在囊胚内表达的研究，共68页，29251字

摘 要

TRIzol 法提取 40℃热应激 1h 小鼠肝脏总 RNA，根据 Genbank 中小鼠 Hsp70

cDNA 序列设计引物，用 RT-PCR 方法克隆了昆明小鼠 Hsp70 cDNA 全长序列

并对其进行序列和分子进化分析。同时将体外培养至囊胚的小鼠胚胎分为 7 组，

每组 50 枚。其中，40℃热应激 3 组，38℃热应激 3 组，分别应激 1h，2h，3h，

然后在 37℃条件下分别恢复 3h，2h，1h；对照 1 组，37℃培养 4h，每组进行

三个重复，然后提取胚胎细胞内总 RNA，根据所测序列和 Genbank 发表序列设

计引物，18S rRNA 引物作为内参，用半定量 RT-PCR 和实时荧光定量 RT-PCR

方法检测热应激小鼠囊胚内 Hsp70 mRNA 的表达水平。试验结果如下：

1. 用 RT-PCR 方法成功克隆了 1926bp 的 Hsp70 cDNA 全长序列，与 Genbank

已发表序列经 BLAST 分析同源性为 99.3%，共有 13 个位点发生突变，导致氨

基酸残基 7 处发生替换，氨基酸列同源性为 98.8%，但是蛋白质等电点无变化，

为 5.516。蛋白二级结构分析显示，α-螺旋占 39％，β-折叠占 10％，Turn（转

角）占 6％，Coil（无规则卷曲）占 45％。

2. 用 DNAStar protean 软件对小鼠 Hsp70 与其他各动物物种 Hsp70 进行分

子进化分析显示，小鼠 Hsp70 与大鼠 Hsp70-1A，Hsp70-1B，Hsp70，牛 Hsp70-1A，

Hsp70-1B，人 Hsp70-1A，Hsp70-1B，狗 Hsp70 同源性较高，与其他物种同源

性相对较低，与山羊 Hsp70 同源性仅为 81.1%。

3. 用 18S rRNA 做内参对小鼠热应激囊胚内 Hsp70 mRNA 的表达进行半定

量分析显示，各试验组，包括对照组都有 Hsp70 基因的表达，其中，38℃热应

激组的小鼠囊胚在热应激开始 1h 后，细胞内 Hsp70 mRNA 水平无明显变化，

热应激 2h 后 Hsp70 mRNA 达到较高水平，之后下降；40℃热应激组在热应激

开始 1h 后小鼠囊胚细胞内 Hsp70 mRNA 就达到较高水平，为对照组的 5.893 倍，

之后随热应激时间延长而下降。

4. 以 18S rRNA 做外标，用实时荧光定量 RT-PCR 定量分析了小鼠囊胚细

胞内 Hsp70 mRNA 的变化水平，结果显示，38℃ 1 h 热应激组的 Hsp70 mRNA

较对照组略有增加，仅增加 4.59 倍，热应激 2 h 后达到较高水平，是对照组的

137.19 倍，然后开始迅速下降，热应激 3h 后，下降到对照组的 29.86 倍。40℃

热应激 1 h 后，胚胎细胞内 Hsp70 mRNA 是对照组的 103.97 倍，然后随应激时

间的延长开始下降，到热应激 2 h 和 3 h 后分别下降至对照组的 51.98 倍和 27.86

倍。

上述结果说明，小鼠囊胚对热应激敏感，轻度、短时间微热应激即可启动

小鼠囊胚诱导型 Hsp70 基因高水平表达。在 38℃和 40℃热应激条件下，胚胎

细胞内 Hsp70 mRNA 分别在热应激开始后 2 h 和 1 h 达到较高水平。

关键词：小鼠；囊胚；热应激；Hsp70 基因；RT-PCR；荧光定量 RT-PCR

目录

中文摘要 .............1

英文摘要 .............3

缩略符号 ...........Ⅰ

文献综述 ............. 1

1 前言 ... 1

2 早期胚胎发育与胚胎基因组的表达........ 1

2.1 早期胚胎发育 ............ 1

2.2 胚胎基因组的表达 .... 2

3 热应激与热休克蛋白 70 ............ 3

3.1 热应激与热休克反应 3

3.2 热休克蛋白概述 ........ 4

3.3 热休克蛋白 70 的分类 ............ 4

3.4 热休克蛋白 70 的生物学特性. 5

3.5 热休克蛋白 70 表达的基因调控........... 5

3.6 热休克蛋白 70 的生物学功能. 6

4 热休克蛋白 70 与早期胚胎发育 7

4.1 体内发育胚胎中热休克蛋白 70 的表达............. 8

4.2 体外培养胚胎中热休克蛋白 70 的表达............. 8

研究内容

试验一 小鼠 Hsp70 cDNA 的克隆与序列分析 ..... 10

1 试验材料 ....... 10

1.1 试验动物 .... 10

1.2 试剂 ............ 10

1.3 仪器设备 .... 11

2 试验方法 ....... 11

2.1 引物的设计与合成 .. 11

2.2 TRIzol 法提取肝脏细胞总 RNA.......... 11

2.3 RT-PCR 反应 ............. 12

2.4 Hsp70 基因的克隆与序列分析 ............ 13

3 结果 . 15

3.1 PCR 扩增结果 ........... 16

3.2 单菌落 PCR 结果 ..... 16

3.3 质粒双酶切鉴定 ...... 16

3.4 测序结果与同源性分析 ........ 17

3.5 小鼠 Hsp70 的氨基酸序列与分子进化分析 .... 20

3.6 Hsp70 基因的二级结构分析 .. 23

4 讨论 . 24

试验二 热应激处理小鼠囊胚 Hsp70 mRNA 的表达.......... 26

1 试验材料 ....... 26

1.1 试验动物 .... 26

1.2 试剂与仪器 27

2 试验方法 ....... 27

2.1 胚胎体外培养 .......... 27

2.2 胚胎分组与体外热应激 ........ 27

2.3 RT-PCR 检测 ............. 27

2.4 Hsp70 基因片段的克隆与序列分析 .... 29

2.5 灰度扫描与数据分析 ............ 30

3 结果 . 30

3.1 PCR 扩增产物的电泳结果 ..... 30

3.2 Hsp70 基因克隆的鉴定结果 .. 31

3.3 测序结果 .... 31

3.4 Hsp70 mRNA 表达的半定量分析........ 32

4 讨论 . 32

试验三 荧光定量 RT-PCR 检测热应激小鼠囊胚 Hsp70 mRNA 的表达 ..... 34

1 试验材料 ....... 34

1.1 材料 ............ 34

1.2 试剂与仪器 34

2 试验方法 ....... 34

2.1 胚胎体外培养与热应激 ........ 34

2.2 引物的设计与合成 .. 35

2.3 胚胎细胞总 RNA 的提取与反转录 .... 35

2.4 实时荧光定量 PCR.. 35

3 结果 . 35

3.1 实时荧光定量 RT-PCR 荧光曲线与熔解曲线 . 35

3.2 Hsp70 基因表达水平的变化 .. 37

4 讨论 . 38

结论 ........... 40

参考文献 ........... 41

致谢 ..... 46

附录 ............. 47

攻读硕士学位期间发表的学术论文 ......... 52

资料文件预览：
共1文件夹，1个文件，文件总大小：2.46MB，压缩后大小：1.93MB

• 硕士论文-小鼠Hsp70基因序列分析及其在囊胚内表达的研究
• 硕士论文-小鼠Hsp70基因序列分析及其在囊胚内表达的研究.doc  [2.46MB]