资料简介：
硕士论文-牛病毒性腹泻病毒NS3基因片段的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立，共75页，44120字
摘 要
牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea virus,BVDV)属于黄病毒科瘟病毒属的
成员。该病毒可引起牛病毒性腹泻-粘膜病（BVD），主要感染牛，还可感染羊、猪、鹿、
骆驼及一些野生反刍动物。牛羊临床症状主要表现为粘膜发炎、糜烂、坏死,腹泻和隐
性感染。该病呈世界性分布，尤其是欧美等养牛业发达的国家。目前，本病分布于我国
所有的区域，也没有疫苗预防，BVD 诊断和监测技术储备严重不足。近年来，在用细胞
生产的疫苗和发病猪群中发现了病原的污染，因此，开展 BVDV 监测技术的研究，界定
发病猪群 BVDV 的来源、危害程度显得尤为重要。
本研究中采用 RT-PCR 及套式 PCR 方法，对来自浙江、湖南、安徽、江西、广西、
辽宁等地的猪病料进行 BVDV 检测，以其对目前我国猪群中 BVDV 感染情况及其来源进行
评价。结果 6 省 43 份猪病料中 7 份呈 BVDV 阳性，阳性率为 16.3%,说明我国猪群中 BVDV
的感染情况已经比较严重，应该予以重视。为追踪 BVDV 在猪体中的流行来源，我们又
对细胞培养用国产及进口犊牛血清及 8 份猪用细胞疫苗进行了检测，结果均能扩增到目
的条带。序列分析表明：血清及疫苗中毒株与上述各省野毒株同源性非常高，提示我们
猪群感染的 BVDV 可能来源于猪用疫苗及细胞苗培养用的犊牛血清。
本文还根据已发表 BVDV 标准株 Oregon c24v 序列设计一对扩增 NS3 基因主要抗原
区域的的特异性引物，用 RT-PCR 方法从 Oregon c24v 标准株病毒核酸中扩增得到 573bp
的目的基因，并将其克隆到 PGEM-Teasy 载体中，测序鉴定阅读框架正确后再亚克隆到
表达载体 pET-32a 中，经 IPTG 诱导后在 E.coli BL21 细菌中成功获得表达。Western Blot
结果显示该重组蛋白可以被 BVDV 阳性血清识别，具有良好的抗原性。
目的蛋白经大量诱导表达，可溶性试验证明重组蛋白以可溶性形式存在于超生裂解
液上清中，用镍柱亲和层析法从上清中纯化了目的蛋白。以纯化后的目的蛋白作为抗原
包被聚乙烯微量反应板，初步建立检测 BVDV 抗体的间接 ELISA 方法。实验表明：抗原
的最适包被浓度为 3.8μg /mL，血清最适稀释度为 1:40；最适封闭液为 5%脱脂奶粉，封
闭条件为 4℃ 过夜，最佳血清及二抗反应条件及时间均为 37℃ 1h；底物显色液的最佳
反应时间为 8min；统计学分析后确定阴阳性的临界值为 0.4。通过特异性试验、重复性
试验、符合性试验及对临床样品检测的结果显示，该方法是一种特异、敏感、快速、操
作简便的方法。这为进一步开发 BVDV 抗体检测试剂盒奠定了基础。
关键字：BVDV；NS3 蛋白；原核表达；间接 ELISA
目录
摘 要............... 1
ABSTRACT... 3
英文缩写词表. 1
文献综述......... 6
1 综述前言..... 6
2 BVDV 形态及理化特性 . 6
3 BVDV 分型 . 6
4 BVDV 基因组结构与功能 ................. 7
5 BVDV 基因组编码的蛋白 ................. 8
6 流行病学研究进展....... 11
7 实验室诊断技术研究进展................ 16
8 BVD 防治研究进展 ...... 20
试验一 猪源牛病毒性腹泻病毒的流行初探......... 23
1 材料........... 23
1.1 样品来源 23
1.2 主要仪器及设备........ 23
1.3 主要试剂及工具酶.... 23
1.4 载体及菌株................ 23
1.5 质粒 DNA 提取用溶液 ................. 23
2 方法........... 24
2.1 引物设计与合成........ 24
2.2 分离毒株总 RNA 的提取 ............. 24
2.3 RT-PCR .. 24
2.4 PCR 扩增产物的凝胶电泳 ........... 25
2.5 PCR 产物回收 ........... 25
2.6 目的基因的克隆、鉴定................ 26
2.7 目的基因序列测定及分析............ 29
3 结果........... 29
3.1 实验样品的 BVDV 套式 PCR 扩增结果 ......... 29
3.2 扩增片段的克隆及鉴定................. 30
3.3 核苷酸序列及氨基酸序列同源性比较分析..... 31
3.4 测得毒株基因亚型的确定............. 31
4 讨论............ 32
试验二 BVDV NS3 基因片段在大肠杆菌中的表达 ................ 34
1 材料........... 34
1.1 病毒和阳性血清........ 34
1.2 主要仪器与设备......... 34
1.3 主要试剂与工具酶.... 34
1.4 载体和菌株................ 34
2 方法........... 36
2.1 RT-PCR .. 36
2.2 目的基因的克隆........ 37
2.3 原核表达载体的构建 37
2.4 重组质粒的诱导表达 39
2.5 SDS-PAGE 电泳 ........ 39
2.6 Western blotting 免疫印迹 ........... 40
3 结果........... 41
3.1 目的基因片段的扩增 41
3.2 重组质粒 PGEM-NS3 的鉴定 ..... 41
3.3 重组质粒 pET32a-NS3 的筛选与鉴定............ 42
3.4 SDS-PAGE 电泳 ....... 42
3.5 Western blotting 免疫印迹 ........... 43
4 讨论........... 43
4.1 目的基因片段的选择 43
4.2 PET32a-NS3 重组表达载体的构建.................. 44
4.3 关于重组蛋白的表达 44
4.4 表达条件的优化........ 45
4.5 表达产物抗原性检测 45
4.6 该蛋白表达成功的意义................ 45
试验三 BVDV 间接 ELISA 检测方法的初步建立 .................. 46
1 材料........... 46
1.1 主要试剂及血清样品. 46
1.2 主要仪器设备............. 46
1.3 用于蛋白纯化及 ELISA 的溶液的配制........... 46
2 方法........... 47
2.1 重组蛋白的大量诱导表达............. 47
2.2 目的蛋白存在情况检测................. 47
2.3 镍柱的处理................ 48
2.4 目的蛋白的纯化......... 48
2.5 纯化蛋白浓度测定..... 49
2.6 重组蛋白间接 ELISA 检测方法的初步研究... 49
3 结果........... 51
3.1 重组蛋白的制备及纯化................ 51
3.2 纯化蛋白浓度测定.... 52
3.3 间接 ELISA 方法的初步建立 ..... 52
4 讨论............ 57
4.1 目的蛋白存在形式检测................. 57
4.2 重组蛋白的纯化......... 57
4.3 间接 ELISA 方法的建立............... 57
4.4 建立的间接 ELISA 方法初步应用.................. 58
4.5 该间接 ELISA 方法建立的意义... 58
全文总结....... 59
参考文献....... 60
致谢............... 65
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